Alexander Vitkovski (alev_biz) wrote,
Alexander Vitkovski
alev_biz

CRISPR-Cas9 избавили от всего лишнего

Американские ученые разработали метод для направленной эволюции белка Cas9 и получили библиотеку его укороченных вариантов. Изначально этот метод применялся в составе системы редактирования генома CRISPR-Cas9 для разрезания ДНК.

CRISPR-Cas9 избавили от всего лишнего
Кристаллическая структура белка Cas9

Самый короткий вариант, который удалось получить исследователям, в полтора раза меньше белка «дикого типа» — он не способен резать ДНК, но по-прежнему может связываться с ней в нужном месте. О своей работе на ежегодной конференции Лабораторий Колд Спринг Харбор, посвященной CRISPR, рассказал руководитель научной группы Дэвид Сэвадж (David Savage) из университета Калифорнии в Беркли. Также он прокомментировал свою работу для редакционной заметки в Science.



C момента первого использования системы CRISPR-Cas9 в клетках человека в 2012 году эта технология получила множество применений, и не только для редактирования генома. Обычно белок Cas9 выполняет в системе функцию «ножниц» и разрезает ДНК там, куда его направил короткий РНК-гид. На основе белка дикого типа исследователи получили модификации, которые направляются в нужный локус генома, но или разрезают только одну цепь, или вообще не режут ДНК, а просто связываются с ней в заданном месте.

На основе таких мутантных белков была получена целая линейка так называемых CRISPR-активаторов, которые содержат в себе, помимо Cas9, и другие функциональные домены. Это белковые фрагменты для подавления или активации транскрипции заданного гена, привлечения ферментов, модифицирующих ДНК и гистоны, и цитозин деаминаза, при помощи которой CRISPR «научили» точечно редактировать геном без разрезов (превратив Cas9 из ножниц в «редактор оснований»).

Проблема создания новых искусственных белков на основе Cas9 — его очень большой размер. «Дикий» Cas9 состоит из 1300 с лишним аминокислот, а его ген содержит четыре тысячи нуклеотидов, что для бактериальных генов довольно-таки много. Связываясь с ДНК, он занимает много места и мешает работе других белков.

Чтобы сделать Cas9 более «поворотливым», калифорнийские ученые решили его укоротить, и применили для этого метод направленной эволюции белков. Суть метода очень проста: в ген, кодирующий белок, случайным образом вносятся мутации, а потом из полученной библиотеки выбираются варианты, способные выполнять нужную функцию. Самое сложное здесь — разработать подходящий метод селекции, который позволит отобрать только функциональные варианты белков. В случае с Cas9 исследователи проверяли способность новых вариантов эффективно связываться с ДНК в нужном участке. Для получения библиотеки вариантов куски гена случайным образом вырезали при помощи двух ферментов. Метод укорочения получил название Minimization by Iterative Size-Exclusion Recombination (MISER), и с его помощью ученые «нарезали» полмиллиона различных вариантов Cas9.

Самый маленький вариант, который удалось получить ученым, содержит «всего» 880 аминокислот, и ДНК резать не способен. Впрочем, от него этого и не требуется — такой белок уже может заменить большой Cas9, например, в составе «редактора оснований», а на освободившееся место ученые смогут привесить еще какой-нибудь полезный белковый домен.

Посмотреть на работу системы CRISPR-Cas9 «вживую» можно в этом анимационном ролике от Visual Science.

Автор: Дарья Спасская





Ссылка на источник

Tags: ДНК, биотехнология, генетика, генная инженерия, инструменты и методы, наука
Subscribe

Posts from This Journal “генная инженерия” Tag

Buy for 20 tokens
На днях наш корреспондент посетила лекцию Георгия Носова (Georgii Nosov), нейробиолога из Университета Мюнстера, который рассказывал о поучительных историях из жизни нейронов и людей, их изучающих. «Главными героями» лекции стали эксперименты, которые сыграли ключевую роль в…
  • Post a new comment

    Error

    Anonymous comments are disabled in this journal

    default userpic

    Your reply will be screened

    Your IP address will be recorded 

  • 0 comments