Alexander Vitkovski (alev_biz) wrote,
Alexander Vitkovski
alev_biz

Category:

Ретроны помогли создать новый инструмент для редактирования генома

Биологи создали инструмент для геномного редактирования, основанный на ретронах — бактериальных генетических элементах. Они позволяют синтезировать внутри клетки одноцепочечную ДНК, которая и служит матрицей для рекомбинации и встройки небольшой последовательности в геном.

Ретроны помогли создать новый инструмент для редактирования генома
Схема геномного редактирования при помощи небольших последовательностей ДНК – олигонуклеотидов. Олигонуклеотид попадает в клетку и садится на комплементарную последовательность в геноме. Между двумя комплементарными геному участками (красный) расположен небольшой участок для встройки (черный). Система удвоения ДНК использует олигонуклеотид как матрицу, из-за чего его последовательность и перезаписывается в новую цепь.

Такой инструмент оказался полезным для создания и анализа большого количества генетических вариантов, а также более эффективным, чем CRISPR-методы. Исследование опубликовано в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences.



На основе защитного механизма бактерий уже создан инструмент редактирования генома — CRISPR\Cas. В состав этого комплекса входит фермент Cas9, который вносит в геном разрывы, и направляющая РНК для доставки белка в нужный локус. Открытие этой системы стало настоящим фурором для биологов — в прошлом году за него даже присудили Нобелевскую премию. Однако даже у такого популярного инструмента есть свои ограничения: так, например, CRISPR\Cas в основном применяют для создания крупных делеций или вставок в геноме. Для создания же большого количества маленьких мутаций в разных клетках этот способ не так удобен.

Для внесения небольших мутаций сейчас используют небольшие одноцепочечные фрагменты ДНК — олигонуклеотиды, которые доставляют в клетки бактерий. Там они находят участки гомологии с геномом и служат матрицей для синтеза новой цепи при удвоении генома. Однако такой способ не подразумевает использование маркеров мутаций: светящихся белков или генов устойчивости к антибиотикам. То есть отследить клетки, в которых прошла рекомбинация после внедрения последовательностей, сложно.

Биологи из медицинской школы Гарварда под руководством Макса Шуберта (Max G. Schubert) создали новый инструмент редактирования генома, который способен вносить разнообразные точечные мутации и включает маркеры для отбора клеток. Этот метод основан на защитном механизме бактерий — ретронах. Ретрон — это небольшой фрагмент одноцепочечной ДНК, который обоими концами прикреплен к фрагменту РНК. Такая молекула получилается в результате считывания ДНК с матрицы РНК (обратной транскрипции) при помощи ретро-транскриптазы.

Исследователи поместили последовательность ДНК ретрона в плазмиду, которую внедрили в клетки бактерий. Внутри клетки в ходе транскрипции с последовательности ДНК синтезировались РНК ретрона. А уже после транскрипции небольшая часть ретрона подверглась обратной транскрипции, в результате чего получались небольшие кусочки одноцепочечной ДНК внутри РНК-молекул. Эти фрагменты ДНК и использовались в качестве доноров в процессе удвоения генома, как и в более ранних методах с олигонуклеотидами.

Сначала такой способ работал не так эффективно, как хотелось бы ученым — среди бактерий, в которые помещалась плазмида, образовывалось слишком мало мутантных клонов. Тогда биологи инактивировали у бактерий гены экзонуклеаз — ферментов, которые расщепляют свободные ДНК и РНК. Также для повышения эффективности исследователи отключили и ферменты мисматч-репарации, чтобы клетка не распознавала и не исправляла две несовпадающие цепи: изначальную и отредактированную. После таких изменений эффективность метода превысила 90 процентов, что в целом даже больше, чем у CRISPR-методов.

Авторы также показали и другое преимущество своей модели — способность маркировать мутантные клетки, чтобы определять их в процессе экспериментов. Для этого они выбрали устойчивость к антибиотикам. Если наделить таким свойством все мутантные клетки и обработать все бактерии антибиотиком, выживут только клетки с мутациями, что и позволит их отличить. Для устойчивости к антибиотикам авторы предложили помимо целевых мутаций для исследования вносить еще и те, что направлены на гены, связанные с устойчивостью. Они протестировали свой подход на целом наборе мутаций, вызывающих у бактерий E.Coli устойчивость к антибиотику рифампицину, и показали его эффективность.

Главное потенциальное применение геномного редактирования с использованием ретронов — внесение небольших мутаций. Такой подход может быть использован, например, для создания большого количества генетических вариантов, чтобы имитировать их влияние на приспособленность и эволюцию. Чтобы имитировать эволюцию каждого варианта из одного генома, биологи предложили фрагментировать этот геном и поместить фрагменты в ретроны, после чего внести каждый вариант в отдельную клетку. Биологи провели такой эксперимент на E.Coli и показали, что в ее геноме действительно можно выделить мутации, дающие преимущество в ходе эволюции — устойчивость к антибиотикам.

После создания первых систем редактирования генома биологи продолжают оптимизировать их и даже создавать новые. Так, например, ученые недавно увеличили эффективность CRISPR\Cas при помощи фотоиндукции, а также создали инструмент, который способен редактировать несколько генов одновременно и вырезать из них участки. Также биологи научились редактировать не только ДНК, но и эпигеном — модификации нуклеотидов и белков, которые влияют на активность генов.

Автор: Анна Муравьёва





Ссылка на источник

Tags: ДНК, бактерии, биология, биотехнология, генетика, геном
Subscribe

Posts from This Journal “биотехнология” Tag

Buy for 20 tokens
По поводу моего вчерашнего поста "Я разорён", каюсь, был не прав, однако получил очень полезный фитбек. Об этом подробно... (фото: Яндекс Картинки, кадр из к/ф Во все тяжкие) Возможно было глупо использовать стандартную подачу информации, а именно "кликбейт", когда пишу…
  • Post a new comment

    Error

    Anonymous comments are disabled in this journal

    default userpic

    Your IP address will be recorded 

  • 1 comment