Alexander Vitkovski (alev_biz) wrote,
Alexander Vitkovski
alev_biz

Category:

Ретроны помогли создать новый инструмент для редактирования генома

Биологи создали инструмент для геномного редактирования, основанный на ретронах — бактериальных генетических элементах. Они позволяют синтезировать внутри клетки одноцепочечную ДНК, которая и служит матрицей для рекомбинации и встройки небольшой последовательности в геном.

Ретроны помогли создать новый инструмент для редактирования генома
Схема геномного редактирования при помощи небольших последовательностей ДНК – олигонуклеотидов. Олигонуклеотид попадает в клетку и садится на комплементарную последовательность в геноме. Между двумя комплементарными геному участками (красный) расположен небольшой участок для встройки (черный). Система удвоения ДНК использует олигонуклеотид как матрицу, из-за чего его последовательность и перезаписывается в новую цепь.

Такой инструмент оказался полезным для создания и анализа большого количества генетических вариантов, а также более эффективным, чем CRISPR-методы. Исследование опубликовано в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences.



На основе защитного механизма бактерий уже создан инструмент редактирования генома — CRISPR\Cas. В состав этого комплекса входит фермент Cas9, который вносит в геном разрывы, и направляющая РНК для доставки белка в нужный локус. Открытие этой системы стало настоящим фурором для биологов — в прошлом году за него даже присудили Нобелевскую премию. Однако даже у такого популярного инструмента есть свои ограничения: так, например, CRISPR\Cas в основном применяют для создания крупных делеций или вставок в геноме. Для создания же большого количества маленьких мутаций в разных клетках этот способ не так удобен.

Для внесения небольших мутаций сейчас используют небольшие одноцепочечные фрагменты ДНК — олигонуклеотиды, которые доставляют в клетки бактерий. Там они находят участки гомологии с геномом и служат матрицей для синтеза новой цепи при удвоении генома. Однако такой способ не подразумевает использование маркеров мутаций: светящихся белков или генов устойчивости к антибиотикам. То есть отследить клетки, в которых прошла рекомбинация после внедрения последовательностей, сложно.

Биологи из медицинской школы Гарварда под руководством Макса Шуберта (Max G. Schubert) создали новый инструмент редактирования генома, который способен вносить разнообразные точечные мутации и включает маркеры для отбора клеток. Этот метод основан на защитном механизме бактерий — ретронах. Ретрон — это небольшой фрагмент одноцепочечной ДНК, который обоими концами прикреплен к фрагменту РНК. Такая молекула получилается в результате считывания ДНК с матрицы РНК (обратной транскрипции) при помощи ретро-транскриптазы.

Исследователи поместили последовательность ДНК ретрона в плазмиду, которую внедрили в клетки бактерий. Внутри клетки в ходе транскрипции с последовательности ДНК синтезировались РНК ретрона. А уже после транскрипции небольшая часть ретрона подверглась обратной транскрипции, в результате чего получались небольшие кусочки одноцепочечной ДНК внутри РНК-молекул. Эти фрагменты ДНК и использовались в качестве доноров в процессе удвоения генома, как и в более ранних методах с олигонуклеотидами.

Сначала такой способ работал не так эффективно, как хотелось бы ученым — среди бактерий, в которые помещалась плазмида, образовывалось слишком мало мутантных клонов. Тогда биологи инактивировали у бактерий гены экзонуклеаз — ферментов, которые расщепляют свободные ДНК и РНК. Также для повышения эффективности исследователи отключили и ферменты мисматч-репарации, чтобы клетка не распознавала и не исправляла две несовпадающие цепи: изначальную и отредактированную. После таких изменений эффективность метода превысила 90 процентов, что в целом даже больше, чем у CRISPR-методов.

Авторы также показали и другое преимущество своей модели — способность маркировать мутантные клетки, чтобы определять их в процессе экспериментов. Для этого они выбрали устойчивость к антибиотикам. Если наделить таким свойством все мутантные клетки и обработать все бактерии антибиотиком, выживут только клетки с мутациями, что и позволит их отличить. Для устойчивости к антибиотикам авторы предложили помимо целевых мутаций для исследования вносить еще и те, что направлены на гены, связанные с устойчивостью. Они протестировали свой подход на целом наборе мутаций, вызывающих у бактерий E.Coli устойчивость к антибиотику рифампицину, и показали его эффективность.

Главное потенциальное применение геномного редактирования с использованием ретронов — внесение небольших мутаций. Такой подход может быть использован, например, для создания большого количества генетических вариантов, чтобы имитировать их влияние на приспособленность и эволюцию. Чтобы имитировать эволюцию каждого варианта из одного генома, биологи предложили фрагментировать этот геном и поместить фрагменты в ретроны, после чего внести каждый вариант в отдельную клетку. Биологи провели такой эксперимент на E.Coli и показали, что в ее геноме действительно можно выделить мутации, дающие преимущество в ходе эволюции — устойчивость к антибиотикам.

После создания первых систем редактирования генома биологи продолжают оптимизировать их и даже создавать новые. Так, например, ученые недавно увеличили эффективность CRISPR\Cas при помощи фотоиндукции, а также создали инструмент, который способен редактировать несколько генов одновременно и вырезать из них участки. Также биологи научились редактировать не только ДНК, но и эпигеном — модификации нуклеотидов и белков, которые влияют на активность генов.

Автор: Анна Муравьёва





Ссылка на источник

Tags: ДНК, бактерии, биология, биотехнология, генетика, геном
Subscribe

Posts from This Journal “биотехнология” Tag

Buy for 10 tokens
Аня Бусева из Минска 25 июня встретит свой 17-й День рождения. У девочки есть одно большое желание, даже скорее мечта. Это не новомодный гаджет, не трендовые одежки из бутика и даже не путешествие к морю. Ане нужна специализированная инвалидная коляска. С рождения девочка получила диагноз…
  • Post a new comment

    Error

    Anonymous comments are disabled in this journal

    default userpic

    Your IP address will be recorded 

  • 1 comment